聂立波教授课题组《Cell Proliferation》：基于支化杂交链式反应用于肿瘤细胞中microRNA的原位成像检测
聂立波教授团队在《Cell Proliferation》期刊发表基于基于支化杂交链式反应用于肿瘤细胞中miRNA的原位成像检测，用于肿瘤相关过表达miRNA的原位成像监测。
原位可视化监测miRNA对于研究miRNA、其相关生物学功能及疾病的诊断至关重要。由于miRNA序列短，丰度低和高度同源序列相似性等特点使传统单一结合探针输出信号的检测方法对细胞内miRNA的检测具有一定难度，并且传统的基于多聚甲醛固定miRNA的荧光原位杂交方法存在泄露损失等问题，限制了原位杂交的灵敏度，使其单细胞水平原位成像miRNA表达水平仍具有较大挑战。
本研究针对传统检测方法在单细胞中miRNA原位成像灵敏度不足的问题，设计了一种基于原位杂交的bHCR-FISH技术用于肿瘤细胞原位检测miRNA。该技术采用了两项关键策略：一是通过共价键固定细胞内的miRNA；二是利用bHCR技术对目标miRNA信号进行放大处理，具体原理如图1所示。具体技术路线如下：1.通过多聚甲醛和EDC相结合来固定细胞中的miRNA，使蛋白质的氨基与miRNA的5'磷酸端不可逆的共价交联在一起，有效防止miRNA的损失；2.以固定的目标 miRNA为引发链与H1，H2发夹探针发生初级HCR反应在原位生成HCR聚合物；3.用封闭了的发夹探针H3与初级HCR聚合物侧链的延伸序列杂交引发二次HCR反应，产生在严格的杂交条件下具有高度聚合度的支化聚合物，从而增强了检测灵敏度；4.为了成像每个bHCR聚合物，我们对H1进行了标记TAMRA使得每个目标miRNA分子可被荧光显微镜可视化为荧光亮点。
图1 基于支化杂交链式反应用于肿瘤细胞中microRNA的原位成像检测原理图
结果表明，该技术能够在单细胞和单分子水平上实现高灵敏度、高选择性的miRNA检测。与传统荧光原位杂交技术相比，该方法显著提升了原位成像检测的灵敏度与成像分辨率。因此，这种基于靶标触发支链杂交链式反应（bHCR）的原位检测方法，为分析疾病相关miRNA表达提供了可靠的检测平台。
图2 扩增差异对比：常规条件HCR凝胶电泳分析（A）；严格杂交条件下与bHCR凝胶电泳分析（B）；原子力显微镜（AFM）成像展示严格荧光原位杂交（FISH）条件下的bHCR产物（C）
图3 不同细胞中miR-21的荧光成像：(A) miR-21 固定方法研究；(B) 经过初级 CR扩增和二次扩增后的HeLa细胞成像；(C)基于bHCR的FISH检测HeLa和HEK-293细胞中的miR-21成像；(D)HeLa 和HEK-293细胞中bHCRPs的平均数量
图4 目标 miRNA-21 在 HeLa 细胞（A）和 HEK-293 细胞（B）中的 Z 叠分析
本研究提出了一种基于支化杂交链式反应用于肿瘤细胞中microRNA的原位成像检测策略。该技术能够在单细胞和单分子水平上实现高灵敏度、高选择性的miRNA检测。与传统荧光原位杂交技术相比，该方法显著提升了原位成像检测的灵敏度与成像分辨率。
聂立波教授为本文通讯作者，唐英副教授为第一作者。
原文链接： https://doi.org/10.1111/cpr.13721
